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研究背景

乙肝病毒（HBV）是迄今所有已知可感染人体并具有独立复制能力的双链DNA病毒中最小且最有效的病毒，仅含3.2 kb，属于嗜肝DNA病毒科。HBV可以引发急性和慢性肝炎，后者又可发展为肝硬化乃至肝癌。HBV感染呈全球性，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5多亿人为慢性HBV感染患者，每年约有786000人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌（HCC）。美国食品药品监督管理局已批准两个Ⅰ型干扰素和5个核苷逆转录酶抑制剂用于乙肝的治疗，但临床效果仍然十分有限。虽然预防乙型肝炎的疫苗在很大程度上减少了慢性乙肝的发生，但疫苗接种覆盖率存在巨大的地域差异性，美国高达90%，而南亚仅占56%。防治指南先后强调了抗病毒是治疗乙肝的重中之重，因而详细阐明HBV的复制机制，并以此为基础，寻找高效低毒的抗病毒作用靶点已成为防治工作者的研究重心，并可为新药研究发现奠定坚实的前期基础。

HBV一旦进入人体，病毒包膜表面上抗原大蛋白（LHBs）N端27~46位氨基酸就与肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸协同转运蛋白（NTPC）结合，病毒颗粒通过受体介导的细胞内吞作用进入细胞，再由细胞微管系统转运至核孔复合物。HBV病毒是240个由两个核心蛋白（core protein，CP）以一定的夹角形成的二聚体亚单位，以一定的空间顺序结合形成的对称的20面体。病毒的CP经未知磷酸化机制暴露核内定位信号，与核孔复合物结合而脱去衣壳，HBV DNA进入核内，病毒颗粒由内吞到入核这一过程需要细胞内GTP激酶信号通路的参与。HBV DNA再经目前机制未明的修复正链缺口转变成超共价闭合环状DNA（cccDNA）。有研究在稳定转染HBV DNA和DHBV DNA的细胞株中分离到去蛋白rcDNA（protein free-rcDNA,PF-RC），并证明PF-RC是rcDNA到cccDNA转变过程的中间体，可能是在胞质核衣壳内，通过某种具有丝氨酸蛋白酶活性的物质切断P蛋白酪氨酸残基与负链5' 端磷酸基团间的磷酸二酯键形成的，rcDNA去蛋白化激发部分核衣壳解聚，暴露核定位信号，通过核孔复合体介导PF-RC转运到核内，然后由宿主细胞相关酶把PF-RC转化成cccDNA。用siRNA抑制核转运蛋白β1表达或表达功能缺陷的转运蛋白β1，均导致胞质PF-RC积聚，而胞核内PF-RC及cccDNA减少。细胞RNA多聚酶Ⅱ以cccDNA为模板，转录产生mRNA。病毒DNA聚合酶（即P蛋白）结合于pgRNA（前基因组RNA，也是3.5kb mRNA）5' 端的茎环结构，促使pgRNA包裹入核心颗粒中，P蛋白TP区第63位酪氨酸残基上的羟基与GTP共价结合引发合成5'-GAAT-3' 的四聚DNA引物，P蛋白与该引物转位到pgRNA3' 端DR1区，以pgRNA为模板转录合成互补性负链DNA，同时DNA聚合酶的RNAse H（核糖核酸酶H）切割模板pgRNA，仅保留5' 端完整的DR1片段，与该片段互补的短小RNA脱离并附着在负链5' 端，引导正链合成。当合成延伸到负链5' 端时，DNA聚合酶模板切换至负链3' 端继续合成正链DNA，形成松弛环状DNA（rcDNA），再移去共价结合在负链5' 端的病毒聚合酶和正链5' 端的短链RNA低聚物（用于启动），就形成了cccDNA。正链合成启动时，核心颗粒结构改变，成为成熟的核心颗粒，可与表面抗原相互识别，以芽生的方式形成完整病毒颗粒。包裹着衣壳的HBV-DNA再由膜包裹后分泌到细胞外，也可以重新脱去衣壳进入细胞核内，以维持细胞核内cccDNA的数量。如下图所示。

就理论而言，病毒复制的各个阶段都有可能成为药物靶点。故针对病毒的吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配分泌各阶段特点，选择相应的有效药物去阻断其生命周期，从而实现抑制乙肝病毒繁殖、扩散。鉴于HBV为迄今已知所有可感染人体并具有独立复制能力的双链DNA病毒中最小且最有效的病毒，人类经过长期的奋斗，人们逐渐开拓治疗的新方略，其中包括：（1）用小分子作用于病毒的变构效应以实现衣壳蛋白、糖蛋白错配不失为抗病毒良策之一，而且在已发表的HBV的文章得到佐证。（2）在HBV组装时，分为两个不同领域应对，把自组装和组装调控分开，各个击破。调控是在变构水平上进行，即调控分子构象的变化，细胞周期一般是蛋白改变其活动，这些蛋白是由效应分子诱导的；调控过程还需要病毒和宿主因子参与。阻隔调控是一个理想的抗病毒治疗的目标，而目前直接实现对病毒组装物理化学性质的调控仍处于初始探索阶段。（3）成核过程是成核单元先形成成核核心，在足够成核单元存在下装配成功；如果成核单元形成成核核心的过程过快，导致余下的成核单元装配不顺利；也有可能在成核过程中，成核单元结合不牢固。（4）研究发现，阳离子细胞穿透肽（CPP）及其脂肪共轭域（CatLip）可以携带不带电荷的生物活性分子进入细胞内。使用感染和转染实验，发现CatLip肽能引起包膜蛋白的积累，导致PreS/S结构域发生严重变化，从而抑制鸭乙型肝炎病毒复制，变性的CPP也为抗病毒治疗提供了新靶点。

研究模型

鼎博建立了HBV体外转染模型：以腺病毒为载体，将1.3倍的HBV转入包装细胞293内，再用包装好的重组病毒（AdHBV1.3）感染HepG2细胞；不仅可以产生高水平的HBV复制，而且可以通过整合在腺病毒骨架质粒上绿色荧光蛋白基因的表达直接观察转染和感染效率。如下图所示。

研究案例

目的：研究双链DNA对HBV复制的影响及其胞内信号传导
结论：ds-DNA能够刺激肝癌细胞产生I型干扰素应答，同时伴随IRF3与NF-kB的活化；ds-DNA能够促进HBV的复制
路线：

1.poly(dA-dT).poly(dT-dA)转染HepG2与HepG2.2.15细胞，qPCR检测I型干扰素IFN-beta、干扰素应答基因IFIT1与炎症因子TNF-alpha的表达，WB检测NF-kB、IRF3、TBK1以及磷酸化的TBK1的表达。

2.HBV1.3复制型质粒转染HepG2细胞，HBV siRNA转染HepG2.2.15，qPCR检测细胞中IFIT1的表达。

3.poly(dA-dT).poly(dT-dA)转染HepG2.2.15细胞，southern blot检测细胞内HBV的复制中间体，qPCR检测细胞上清中HBV颗粒，CMIA检测HBV s抗原与e抗原的表达。利用抑制剂阻断NF-kB、IRF3以及MAPK激酶信号通路，southern blot观察poly(dA-dT).poly(dT-dA)对肝细胞内HBV复制中间体的影响。WB检测细胞内ERK1/2的磷酸化。

核心文献

1.Hepatitis B virus infection[J]. Lancet, 2014, pii:S0140-6736(14)60220-8. https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(14)60220-8/abstract

2.Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 2016 Mar 17;531(7594):386-9. https://www.nature.com/nature/journal/v531/n7594/full/nature17170.html

3.New therapeutic agents for chronic hepatitis B. Lancet Infect Dis. 2016 Jan 12;S1473-3099(15)00436-3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26795693

4.HBV-specific and global T-cell dysfunction in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 2015 Dec 9;S0016-5085(15)01736-9. https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0016-5085(15)01736-9

5.Infection and Cancer: The Case of Hepatitis B. J Clin Oncol. 2016 Jan 1;34(1):83-90. https://jco.ascopubs.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=26578611